高效液相色譜儀系統構造介紹

　　高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統組成。

　　1.進(jìn)樣系統

　　一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作進(jìn)樣量是恒定的。

　　這對提高分析樣品的重復性是有益的。

　　2.輸液系統

　　該系統包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47~4.4X107Pa流速可調且穩定，當高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存錯和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變包括改變洗脫液的極性、離子強度、pH值或改用

　　3.分離系統

　　該系統包括：色譜柱、連接管和恒溫器等。

　　色譜柱一般長(cháng)度為10~50cm(需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管)內徑為2~5mm，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內裝有直徑為5~10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構成)，固定相中的基質(zhì)是由機械強度高的樹(shù)脂或硅膠構成，它們都有惰性(如，硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過(guò)機械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如，磷酸基、苯基、季胺基、羥甲基、氨基或各種長(cháng)度碳鏈的烷基等)或配體的有機化合物。

　　因此，這類(lèi)固定相對結構不同的物質(zhì)有良好的選擇性，例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來(lái)。

　　另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴散效應?；|(zhì)粒度小、微孔淺，樣品在微孔區內傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數N就越大。

　　這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會(huì )提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60℃通過(guò)改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。

　　4.檢測系統

　　高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種：

　　(1)紫外檢測器

　　該檢測器適用于對紫外光(或可見(jiàn)光)有吸收性能樣品的檢測。

　　其特點(diǎn):使用面廣(如，蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)；靈敏度高(檢測下限為10-10g/mL)；線(xiàn)性范圍寬;對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。

　　(2)示差折光檢測器

　　凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。糖類(lèi)化合物的檢測使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低(檢測下限為10-7g/mL)流動(dòng)相的變化會(huì )引起折光率的變化。因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。

　　(3)熒光檢測器

　　凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物(如，多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類(lèi)、維生素和某些蛋白質(zhì)等)的測定，其靈敏度很高(檢測下限為10-12~10-14g/mL）痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。

　　5.數據處理系統

　　該系統可對測試數據進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開(kāi)展。

　　高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎上引用了氣相色譜的理論。在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數可達幾萬(wàn)或幾十萬(wàn))；同時(shí)，柱后連有高靈敏度的檢測器可對流出物進(jìn)行連續檢測。